Szabadság előtti záróakkordok

A nyár közepére kicsit felpörögtek a dolgok. Jól sikerültek a real time PCR-ok, bár időnként adódik egy kis nehézség. A módszereken még mindig finomítani kell, sajnos a minták elég későn jönnek fel, és a clock, bmal sem működik még rendesen. Emiatt néhány hámtumoros mintán kellett "gyakorolni". A per1 nagyon jól dolgozik, a COP1 és a cry1 is jó jelet ad, a per2 viszont időnként gyengélkedik. A pikkelysömörös tünetes és tünetmentes bőr közötti különbség nagyon jól és egyértelműen ábrázolódik. Jelentős a különbség az éjféli és a déli minták között is, az expresszió napi ingadozása is körvonalazódik. Szintén új előrelépés, hogy most már segítségem is van, nem egyedül végzem a labormunkát, hanem egy új kolléganő személyében lelkes társam akadt.
További jó hír, hogy megérkeztek az új primerek. Sajnos, a COP1 ellenanyag még mindig nem. Ez a legnehezebb része a dolognak, várni, és várni, hogy egyáltalán előre tudjon lépni az ember. Emiatt az immunhisztokémia beállításán még egyáltalán nem agyaltam. De most egy darabig nem is tervezem. Eljött a jól megérdemelt szabadság ideje. Néhány hétre pihennek a minták, és én is.
Jó pihenést és további szép nyarat mindenkinek! Szeptemberben jelentkezem. :)

Dübörög a munka

Az RNS-ek elvesztése felett érzett mély fájdalmamon hamar túljutottam. Szerencsére gyors segítség adódott. A mintákat rejtő mélyhűtő mélyéből feltűntek apró eppendorf csövek, melyek korábban levett pikkelysömörös betegek mintáit tartalmazták. A legjobbkor jött a felmentő sereg! A melanomás mintákhoz hasonlóan ugyancsak a cirkadián ritmus vizsgálata volt a cél, és ehhez igazodva éjfélkor, 6-kor és déli 12 órakor levett bőrminták feldolgozása történt korábban. Gyors számvetés, egy-két apró előkészítő fázis, és máris készen álltak a cDNS minták, melyek szép mennyiségben és megfelelő módon álltak rendelkezésre. Ettől kezdve nem volt akadály.

Először csak a COP1-es primer lett bevetve. Jól működött, szóval jött a többi, per2, cry1, per1, majd a clock, és a bmal is, a régi jól beállított kit-ek, háztartási génként actint alkalmazva. Minden nap egy real-time PCR, de néha kettő is. A minták jók. A primerek működnek. Most itt a temérdek adat, mely gyors feldolgozásra vár csak. Elég nagy a csúszás a kitűzött tervhez, ezért ha közelebbit szeretnénk tudni a pikkelysömörös betegek cirkadián ritmusáról, hamar neki kell látni. Szerencsére még az idő is a segítségemre van. Verőfényes napsütésben a strandon nehezebben venném rá magam az analízisre, de ebben a szakadó esőben nincs túl sok választásom. :(

Régi RNS nem cDNS

Sajnos, bekövetkezett, amitől tartottam. A hároméves RNS mintákon nyomot hagyott az idő. Még -20°C-on is jelentős részük elbomlott. A korábbi melanomás minták feldolgozása kudarcot vallott. A real-time RT-PCR során a sokadjára átírt minták közül is csak 3-4 minta jött fel. De tovább kell lépni! Ha nincs melanomás minta, akkor jön a psoriasis. Korábban a PCR beállítása psoriasisos (pikkelyömörös) mintákon történt, így egyelőre nem marad más, mint ezen minták fel dolgozása. Jó lenne a clock, per2, cry1 vizsgálata ezeken, aztán beállítani a p53-at és az Mdm2-t is, ugyanúgy, ahogy a melanomás mintákon terveztem. Még azért hátravan a PCR pontosítása, mivel úgy tűnik, hogy az actin és COP1 együttes futtatásakor az actin nagyon későn jön fel, tehát a kettő együtt nem biztos, hogy működni fog. Lassan azért majd ábrát is tudok mellékelni, a sok elméleti és általános szöveg mellé. :)

Isten malmai lassan őrölnek

A gyakorlati tennivalók mellett muszáj elővenni a betegek adatait. Hiszen nemcsak egy szövetdarabot, egy kis DNS részletet vizsgálunk, hanem a hozzá tartozó embert is. 22 melanomás beteg kórtörténetét kezdtem el átvizsgálni. Eddig 10-nél tartok. Érdekes egyveleg, különböző korú emberek, különböző vastagságú tumorok, változó kimenetel. A teljes összesítés úgyis csak hétvégére lesz meg, de kíváncsian várom a konklúziót. A melanoma nem egy könnyen behatárolható daganatos betegség.

Első lépések

A cDNS-ek sajnos nem bírták keddig. Valahova elbújtak. Ez sajnos gyakori jelenség egy jól működő labor életében, a zsúfolt mélyhűtők nem éppen a jól kategorizált könyvtári polcokhoz hasonlóak. Talán meglesznek valahol. Persze, az RNS-ek megvannak, de 1-2 év után már nem sok remény fűzhető hozzájuk. A primer tesztelése azért megtörtént, de egy apró technikai baki miatt nem lett értékelhető eredmény. Majd legközelebb, menni fog ez. Mindenesetre, ha van már COP1 primer, azt mondom, legyen Mdm2 is, a p53-ról már nem is beszélve. :) Jó, persze, ez nem rajtam múlik, hanem a piszkos anyagiakon. Szerencsére, úgy alakultak a körülmények, hogy van rá lehetőség, szóval ezt ki kell használni.

Előkészületek

2013. április 20. 
         Erdős Pál Ösztöndíjasként a díjazottakat érintő adminisztratív teendők letudtával a laboratórium felé veszem az irányt. Hosszabb kihagyást követően előkerülnek az Eppendorf-csövek, a pipetták, a PCR készülék, és persze a primerek. A lelkes blogírásnak az adta az utolsó löketet, hogy húsvét előtti nagypénteken megkaptam az infót, megérkeztek a primerek. Bokros teendőim közepette (húsvéti sonka elfogyasztása, húsvéti sütipaletta végigkóstolása, locsolkodók fogadása, teltségérzet miatti önsajnálat) nem tudok azonnal a cDNS-ek előkeresésébe fogni, remélem, kibírják keddig nélkülem.



Rövid összefoglaló azoknak, akik "csak" most kapcsolódnak be (akárcsak én a blogírásba ;) ):

1. 2014. március 17. a Nemzeti Kiválóság Program keretében meghirdetett Erdős Pál Ösztöndíj országosan meghirdetett programjában ösztöndíjas lettem; a kutatási program teljesítésén kívül vállalt kötelezettségek egyike az "Így kutattunk mi" blog vezetése, a kutatómunkáról való beszámoló elektronikus napló formájában való közzététele;
      - a kutatási program részben a korábbi kutatómunkám, a COP1 növényi fehérje vizsgálata humán keratinocitákban, az emberi bőr sejtjeiben, és ezen belül is a fehérje szabályozó szerepének tanulmányozása az UV-fényre adott válasz során
      - a COP1 fehérje egy erősen konzervált fehérje, mely az emberi sejtekben is jelen van; a növényekben a fény-indukálta növekedés központi regulátora; de joggal merül fel a kérdés, hogy akkor mi a funkciója az emberi sejtekben?
      - mivel a növényekben a cirkadián ritmus, vagyis a napi ritmus szabályozásában is részt vesz, érdekesnek tűnik az a felvetés, hogy a humán szervezetben is lehet szerepe a napi ritmus regulálásában

2. 2014. április első hete: rövid külföldi tanulmányút korábbi, klinikai vizsgálatok eredményeivel konferencián való részvétel gyógyszerallergia témában

3. 2014. április második hete: a vizsgálathoz szükséges laboratóriumi felszerelés adott, a vizsgálandó minták (20 melanomában szenvedő betegtől vett RNS minta, melynek átírása már korábban, egy előző vizsgálat során megtörtént) adottak, amire szükség van: új primerek, a COP1 gén expressziójának vizsgálatához